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3 1 0 2唾液酸測(cè)定法

(間苯二酚顯色法）

本法系用酸水解方法將結(jié)合狀態(tài)的唾液酸變成游離狀

態(tài)，游離狀態(tài)的唾液酸與間苯二酚反應(yīng)生成有色化合物，再

用有機(jī)酸萃取后，測(cè)定唾液酸含量。

睡液釀對(duì)照品溶液（200pg/inl)的制備精密稱取唾液

酸對(duì)照品10.52mg(lMg 唾液酸相當(dāng)于3. 24mnol)，置10ml

量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，混勻，即為唾液酸貯備液

( lm g /m l) ,按一次使用量分裝，一7CTC貯存，有效期1 年。

僅可凍融1次。4°C保存使用期為2 周。精密量取唾液酸貯

備液l m l ,置5m l量瓶中，加水至刻度，即為每lm l含

200Mg 的唾液酸對(duì)照品溶液，用前配制。

用于C 群腦膜炎奈瑟球菌多糖疫苗唾液酸含量測(cè)定時(shí)，

同法制備濃度為400Mg /m l的唾液酸對(duì)照品溶液貯備液（精

密稱取唾液酸40mg，置100ml量瓶中，用純化水溶解并定

容至刻度，混勻，即得）。精密量取唾液酸貯備液2.0ml，

置10ml量瓶、中，加水至刻度，即為每lm l含唾液酸80邶的

唾液酸對(duì)照& 溶液，用前配制。

測(cè)定法取供試品適量，加水稀釋至蛋白質(zhì)濃度為每

. 226 .

lm l含0.2.0.4mg，作為供試品溶液。按下表取唾液酸對(duì)

照品溶液、水及供試品溶液于10ml玻璃試管中，混勻，每

管再加人間苯二酚-鹽酸溶液（分別量取2% 間苯二酚溶液

2.5ml、0. lm o l/L 硫酸銅溶液 62. 5^1、25% 鹽酸溶液 20ml，

加水稀釋至25ml，混勻。試驗(yàn)前4 小時(shí)內(nèi)配制）lm l，加蓋，

沸水煮沸3 0分鐘（水浴面高于液面約2cm)，取出置冰浴中3

分鐘（同時(shí)振搖)后，每管加乙酸丁酯-丁醇溶液（取4 體積乙

酸丁酯與1 體積丁醇混勻，室溫下保存，1 2小時(shí)內(nèi)使用）

2ml，充分混勻，室溫放置1 0分鐘，照紫外-可見(jiàn)分光光度

法（通則0401)，在波長(zhǎng)580nm處測(cè)定吸光度。

唾液酸含量(Mg)

供試品

空白2 4 5 6 8

唾液酸對(duì)照品溶液(卩1) 10 20 25 30 40

水( Ml) 100 90 80 75 70 60

供試品溶液( Ml) 100

腦膜炎球菌疫苗唾液酸含量測(cè)定：取含唾液酸約4CVg/ml

的供試品溶液和純水對(duì)照各2ml, 另分別取唾液酸對(duì)照品

(80/^g/ml) 0. lm l、0.2ml、0_4ml、0_ 8ml、1.6ml 于各管中，

補(bǔ)水至2，O m l為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)。各管加2 m l顯色劑

(0. lm o l/L硫酸銅溶液0.5ml、4%間苯二酚溶液5ml，濃鹽

酸80ml，補(bǔ)水至100ml混勻。臨用現(xiàn)配）搖勻，沸水浴15

分鐘后冰浴5.10分鐘，每管加4m l有機(jī)相（正丁醇15ml，

加乙酸丁酯定容至100ml)，充分搖勻后置室溫10分鐘。以

純水對(duì)照為0 點(diǎn)，于585nm測(cè)定吸光度，并作直線回歸。

(可按比例縮小供試品及各試劑體積）

以唾液酸對(duì)照品溶液的濃度對(duì)其相應(yīng)的吸光度作直線回

歸（相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0 .99)，由直線回歸方程計(jì)算5Mg 唾液

酸的吸光度值，再按下式計(jì)算供試品唾液酸含量。

促紅素供試品唾液酸含量— A 2X 5X3. 2A XW X n

(mol/mol 蛋白質(zhì)） A7XPXTOO

式中烏為5Mg 唾液酸的吸光度；

A 2為供試品的吸光度；

. 為供試品稀釋倍數(shù)；

P 為供試品蛋白質(zhì)含量，Mg /p l;

W 為lrn n o l促紅素的量（不包括糖成分量），相當(dāng)

于 30. 6/xg0

腦膜炎奈瑟球菌多糖疫苗供試品唾液酸含量（/ x g /m l) =

A X n中A 為供試品溶液吸光度相對(duì)于唾液酸對(duì)照品溶液的濃

度，fig /m li

n 為供試品的稀釋倍數(shù)。